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phospho-S6,在自噬信号通路中的研究(一)
自噬
自噬基因（autophagy-related gene，ATG）的克隆始于酵母（yeast）。第一个酵母自噬基因（ATG）于1997年被日本科学家Yoshinori Ohsumi小组克隆，命名为Atg1，文章发表在《Gene》上
（）。第一个哺乳动物自噬基因于1998年被美国科学家Beth Levine小组克隆，命名为Beclin 1，发表在《J Virol》上 （ ），第一作者为Xiao Huan Liang。截止到2010年9月已经克隆34个ATG基因。
Beclin 1和cathepsinD表
功能
目前普遍认为自噬是一种防御和应激调控机制。细胞可以通过自噬和溶酶体，消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质与核酸等生物大分子。为细胞的重建、再生和修复提供必须原料，实现细胞的再循环和再利用。它既是体内的“垃圾处理厂”，也是“废品回收站”；它既可以抵御病原体的入侵，又可保卫细胞免受细胞内毒物的损伤。因此一般说来，凋亡是程序化细胞死亡，自噬是程序化细胞存活。但是过多或过少的自噬却危害细胞。某些情况下，自噬可引起细胞死亡，因此早期一些文献也称自噬为Ⅱ型程序性细胞死亡，但现在已经名不副实（参见 ）。
检测方法
检测金标准是通过电镜看到膜状结构的自噬体以及其他相关亚细胞结构。文献最常用的方法是蛋白印迹检测自噬标志物LC3的转换（LC3-II/LC3-I）以及荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。由于LC3本身也最终经溶酶体降解，因此需要结合一些溶酶体抑制剂使用联合检测。此外， 2009年的一篇Nature文章证实了非LC3依赖性途径的自噬（ ）。毫无疑问随着研究的深入，自噬机制也会变得错综复杂。其他主要方法和结果解
释参见 。
研究热点
目前最前沿的三个领域是：1）自噬体膜的来源问题；2）细胞器自噬，特别是线粒体自噬（mitophagy），3）Beclin 1复合物的形成和调控蛋白以及mTOR 信号通路在自噬中的作用。
自噬抑制剂氯喹(choroquine diphosphate salt)购买于SIGMA公司
一、自噬诱导剂
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）【phospho-S6,在自噬信号通路中的研究】
(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin：mTOR抑制剂【phospho-S6,在自噬信号通路中的研究】
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
二、自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂【phospho-S6,在自噬信号通路中的研究】
(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
三、自噬过程进行观察和检测
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。
※GFP-LC3 单荧光自噬指示体系：
利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62（自噬降解底物）来验证。
※mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：
用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。
3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异
5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰戊二胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
6、CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
四、自噬相关蛋白的定位
在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）
用单丹磺酰尸胺(MDC)染色后荧光显微镜、流式细胞仪、检测细胞自噬，反转录(RT)一PCR检测自噬基因Atg3mRNA和At95mRNA的表达。
经MCD染色后，经流式细胞仪以488nm为激发波长检测MDC阳性细胞率。
目前，人们对自噬的检测主要包括基于检测自噬体的直接(观察自噬体的形态)和间接(检测自噬体表面蛋白标记)的方法以及基于自噬性降解原理设计的一些方法。除此之外，还可通过对自噬通路的调控来全面评价自噬功能对细胞行为或机体功能的影响，如自噬抑制或激活剂、自噬相关基因的敲除及沉默等。
除了电镜下的形态学观察外，自噬体标记蛋白LC3的检测是目前常用的方法，在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成，更有mRFP-GFP-LC3双标蛋白的自噬检测（详细情况点此查看）等。
双荧光LC3细胞自噬腺病毒
mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。
如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以及自噬流。
红色斑点是自噬溶酶体（mRFP），黄色斑点是自噬体（RFP+GFP）. 通过不同颜色斑点的计数可以清晰看出自噬流的强弱，实时监测自噬发生过程，准确，清晰，直观！ （自噬LC3双标腺病毒由汉恒生物独家提供）
本文来源：http://www.zhuodaoren.com/shenghuo283519/
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