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河北省高速刘少伟创新工作室(一)
沙漠枯草芽孢杆菌PJS产生的环脂肽类抗生素研究
【河北省高速刘少伟创新工作室】 [摘要] 目的 分离鉴定枯草芽孢杆菌PJS发酵液中的环脂肽类抗生素PJS-0。 方法 采用溶剂萃取、薄层色谱（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）等分离方法对菌株PJS发酵产物的活性组分PJS-0进行分离；并通过紫外（UV）、质谱（MS）和核磁共振波谱（NMR）联合分析对其结构进行鉴定。 结果 从塔克拉玛干沙漠来源植物内生枯草芽孢杆菌PJS的发酵液中分离得到一个环脂肽类抗生素：PJS-0，经结构鉴定为Mojavensin A。 结论 本文首次从陆生芽孢杆菌中分离得到Mojavensin A，并首次用ESI+-MS/MS对其氨基酸序列进行鉴定。
[关键词] 塔克拉玛干沙漠；枯草芽孢杆菌；环脂肽类抗生素；Mojavensin A；结构鉴定
[中图分类号] S476[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2014）05（b）-0091-05
Study on the cyclic lipopeptide group antibiotic produced by Bacillus subtilis strain PJS from desert
JIANG Zhongke▲ LIU Shaowei▲ LIU Jiameng SUN Chenghang
Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
[Abstract] Objective To isolate and identify compound PJS-0 from the fermentation broth produced by Bacillus subtilis strain PJS. Methods Compound PJS-0 was isolated and purified by using solvent extraction, TLC and HPLC. UV, MS and NMR were analyzed to elucidate the structure of PJS-0. Results Compound PJS-0 was obtained from the fermentation broth produced by Bacillus subtilis strain PJS isolated from Taklamakan Desert, and structurally identified as Mojavensin A, acyclic lipopeptide group antibiotic. Conclusion Mojavensin A is discovered from the fermentation broth of terrestrial-derived Bacillus subtilis strain PJS for the first time and amino acid sequence of Mojavensin A is also analyzed by the tandem mass spectrometry method (ESI+-MS/MS) for the first time.
[Key words] Taklamakan Desert; Bacillus subtilis; Cyclic lipopeptide; Mojavensin A; Structure identification
特殊生态环境栖息着大量尚未经过大规模筛选的特殊微生物，从中发现具有生物活性的新抗生素可能性较大，是微生物药物新的源泉[1]。枯草芽孢杆菌PJS是来源于塔克拉玛干沙漠特境的植物内生菌，该菌株具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）活性且分泌具有四氢嘧啶环的新Amicoumacin类抗生素――PJS[2]。在对其活性次级代谢产物的进一步分离过程中，发现一个具有较强抗真菌活性的环脂肽类抗生素――PJS-0。本文报道了PJS-0的分离纯化，1D-NMR及ESI+-MS/MS的结构鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株枯草芽孢杆菌PJS为中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所从塔克拉玛干沙漠未知植物叶片中分离，经16S rRNA测序及分子分类学比对表明其序列与Bacillus subtilissubsp. inaquosorum BGSC 3A28T（EU138467）菌株的相似率为100%，因此鉴定菌株PJS为枯草芽孢杆菌沙漠亚种Bacillus subtilissubsp. inaquosorum。
1.1.2 试剂乙酸乙酯、甲醇等均为北京化工厂生产的分析纯试剂；HPLC试剂：甲醇为色谱级（Dickma，美国），水为屈臣氏蒸馏水（中国）。
1.1.3 分离填料TLC板，Silica gel 60 F254铝箔板及玻璃板为德国Merck公司产品；高效液相色谱半制备柱：Zorbax SB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）和高效液相色谱分析柱：Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）均为美国安捷伦公司产品。
1.1.4 仪器CAMAG Linomat 5半自动点样仪、ADC 2全自动展开仪、TLC Visualizer薄层色谱数码相机成像系统（瑞士）；高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT系统（LC-20ATVP二元泵，SPD-20AVP 检测器，CBM-20A中央控制器，LC-Solution工作站）（日本）；旋转蒸发仪：EYELAOSB-2100（日本）；离心浓缩机：CHR-ISTRVC2-18型（德国）；冷冻干燥机：LABCONCOF-REEZONE6L型冷干机（美国）。
1.2 方法
1.2.1 PJS菌株的发酵将生长良好的菌株PJS斜面接种至含50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，置于28℃、180 r/min摇床上旋转振荡培养24 h，然后转接于含1000 mL发酵培养基的5000 mL三角瓶中，28℃、180 r/min摇床上旋转振荡培养48 h，收获发酵液。
1.2.2 PJS-0的分离纯化菌株PJS发酵液（80 L）经4500 r/min，20 min离心后，上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机相经无水Na2SO4脱水，减压浓缩，得到淡黄色油状粗提物2.3 g。粗提物用少量甲醇溶解后，用CAMAG LINOMAT5半自动点样仪点样于硅胶10 cm×10 cm硅胶板（Silica gel 60 F254，Merck）上，以氯仿∶甲醇=65∶35为展开剂，上行展开分离。按展开方向从下至上刮下9条带，在稻瘟平板上测活，目标条带为TLC板上0号条带。将0号条带全部刮下，刮下的硅胶粉装于小玻璃柱（15 cm×1.5 cm），用适当体积的甲醇进行洗脱，洗脱液减压浓缩后，用少量甲醇溶解，经0.22 μm滤膜过滤后，得到含有目标化合物PJS-0的半纯品144 mg。半纯品溶于1 mL甲醇，用流动相为73%甲醇水溶液洗脱，流速为2 mL/min，检测波长为210 nm。收集保留时间为28 min左右的紫外吸收峰，合并后，旋转蒸发除去甲醇，经过冷冻干燥获得PJS-0共6.8 mg。应用4.6 mm×150 mm，粒径5 μm的Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，对纯品PJS-0纯度进行HPLC分析，流动相为65%的甲醇水溶液，流速为1 mL/min，检测波长为230 nm。PJS-0的保留时间为16.8 min，纯度为97%。
2 结果
2.1 化合物PJS-0的理化性质
冷干品PJS-0为白色无定形粉末，易溶于甲醇、乙腈和二甲基亚砜（DMSO），不溶于环己烷，微溶于水。UV光谱显示其在207、230、276 nm处有最大吸收。
2.2 化合物PJS-0的结构鉴定
根据其紫外特征及枯草芽孢杆菌的代谢产物结构类型，初步判断其为脂肽类抗生素。ESI-MS（+）图谱显示PJS-0的准分子离子峰[M+H]+为1084.52，[M+Na]+为1106.59，确定该化合物的分子量为1083，HR-ESI-MS数据显示其[M+H]+测量值为1084.581 25，理论值为1084.578 57，可确定其分子式为C50H77N13O14，不饱和度为19。13C-NMR（150MHZ，DMSO-d6）显示PJS-0有12个羰基碳（δ 174.4-170.3），1个对位取代苯环（δ 155.8，127.7，129.8，129.8，115.1，115.1），9个次甲基碳（δ 60.8-49.8，46.0，33.7），其中可能包括7个同氮氧相连的碳，20个亚甲基碳（δ 47.4-25.4），2个甲基碳（δ 19.1，11.2）。结合分子式、13C-NMR数据与已知的脂肽类化合物文献比较（表1），初步确定了PJS-0化学结构与Mojavensin A[3]一致，结构见图1。
表1 PJS-0同Mojavensin A[3]在氘代二甲基亚砜中的
13C-NMR数据比较（150 MHz）
图1 PJS-0的平面结构
为了进一步确定其结构，笔者对PJS-0进行ESI-MS-MS分析，ESI-MS2鉴定脂肽类化合物结构的原理是通过源内碰撞诱导解离（CID）技术获得化合物的质子化或碱金属加合离子碎片，将肽键断裂产生的N端系列b型离子峰和C端系列y型离子峰同理论计算值相比较，从而推导出其分子结构[4-7]。由于质荷比为542.8的[M+2H]+丰度最高，故选择[M+2H]+峰作为母离子峰，化合物PJS-0的ESI+-MS2图见图2。
根据[M-Gln+H]的m/z=956.2，[M-Gln-Asn+H]的m/z=842.5，[M-Gln-Asn-Tyr+H]的m/z=679.4，[M-Gln-Asn-Tyr-Asn+H]的m/z=565.3可以推导出分子中存在Gln-Asn-Tyr-Asn这一肽片段结构；根据[Pro-Asn+H]的m/z=212，[Pro-Asn-Asn+H]的m/z=326.1，[Asn-βAA-Asn-Asn+H]的m/z=582.5，可以推导出分子中存在βAA-Asn-Asn-Pro这一肽片段结构；根据[βAA-Asn-Tyr+H]的m/z=517.1这一肽段的存在提示PJS-0中有Gln-Asn-Tyr-Asn-βAA-Asn-Asn-Pro这一肽段。根据βAA的m/z =b4-b3=239，可以推断脂肪酸链有15个碳原子。因为化合物首先失去的是氨基酸残基：[M-Gln+H]，所以该脂肽化合物应为环状结构[8]，见图3。
图3 PJS-0的环状结构
图4是Mojavensin A产生的b型和y型理论特征碎片离子，除部分y型碎片离子因丰度太小未检测到外，其余的特征峰同图4的实际测定值基本一致，说明测定的结果和理论值相符。综合以上信息，确定了PJS-0平面化学结构与Mojavensin A一致。
图4 PJS-0（氢离子加合物）产生的b型和y型特征离子碎片理论值
3 讨论
PJS-0与Mojavensin A的平面化学结构一致，为首次从陆生芽孢杆菌中分离得到。该类抗生素因为达托霉素2003在美国上市而备受关注。达托霉素是土壤玫瑰孢链霉菌产生的环脂肽A21978C的N-癸酰基衍生物，它是近40年来除恶唑烷酮类抗生素之外，应用到临床的唯一新结构类别抗生素，也是环脂肽类抗生素家族的第一个产品，其抗菌作用机制与已批准的抗生素都不相同，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素金葡菌（VRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌（HVISA）等均具有很好的杀菌效果，上市至今仅有极少的耐药发生[9-13]。环脂肽类抗生素表现出广泛的生物活性，除抗菌外，还包括抗肿瘤、抗炎、免疫抑制、抗病毒等[14-17]，其主要来源于微生物的次级代谢产物，包括海洋蓝细菌，细菌及放线菌等都可产生[18]。其中芽孢杆菌属细菌是环脂肽类抗生素的主要来源，芽孢杆菌属细菌主要产生三种结构相似的环脂肽类成分：伊枯草菌素（Iturin）家族、表面活性素（Surfactin）家族、丰原素（Fengycins）家族[19]。PJS-0即属伊枯草菌素家族，该化合物最早是2012年中国科学院沈阳应用生态所马综旺等从一株海洋特境来源芽孢杆菌Bacillus mojavensis B0621A的培养物中首次发现，该化合物对多种植物真菌具有抑制活性，而且还对人白血病细胞系（HL-60）显示出一定的抑制活性[3]。
环脂肽类化合物尤其是芽孢杆菌属产生的该类化合物具有典型的串联质谱（CID-MS/MS）裂解规律[20-22]。伊枯草菌素家族以脂肪酸链的β氨基所形成的酰胺键及脯氨酸所形成的肽键断裂为主（如本文分离到的伊枯草菌素家族化合物PJS-0的MS2图）[23-24]；表面活性素家族以内酯键优先开裂，其内酯结构在裂解时发生双氢转移（DHT），产生比简单的酰胺键断裂产生的残基大18（H2O）的y型离子特征峰[5-8]；丰原素家族则因组成氨基酸的不同可在不同的位置断裂开环[25-27]。这些环脂肽类化合物断裂开环后都会产生一系列的b型和y型系列离子峰，同理论计算值相比较，即可获得氨基酸组成、连接顺序和脂肪酸侧链的链长信息。由于该类化合物分子量大多在800以上，利用NMR解析较为繁琐且难度也较大[28]，所以利用碰撞诱导解离串联质谱（CID-MS/MS）技术进行LC-MS/MS多级质谱研究，结合DNP、Sci-finder等数据库查询及文献对照，可以对该类化合物进行简单、快速地鉴别。但需要指出的是，使用MS2手段鉴定该类化合物时，对脂肪酸侧链的异构并不能确定。也有文献报道，将脂肪酸侧链水解后通过GC-MS能对常见环脂肽类的侧链异构进行鉴别[29]。对于一些质谱难以确定异构类型的脂肪酸侧链以及环脂肽类化合物的立体构型则需要通过NMR、X-衍射等确定。
[参考文献]
[1]Berdy J. Bioactive microbial metabolites―A personal view [J]. The Journal of Antibiotics，2005，58：1-26.
[2]Liu SW， Jin J， Chen C， et al. PJS， a novel isocoumarin with hexahydropyrimidine ring from Bacillus subtilis PJS [J]. The Journal of Antibiotics，2013，（66）：281-284.
[3]Ma ZW， Wang N， Hu JC， et al. Isolation and characterization of a new iturinic lipopeptide， mojavensin A produced by a marine-derived bacterium Bacillus mojavensis B0621A [J]. The Journal of Antibiotics，2012，65（6）：317-322.
[4]Papayannopoulos IA. The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides[J]. Mass Spectrometry Review，1995，14：49-73.
[5]Hue N， Serani L， Lapre O. Structural investigation of cyclic peptidolipids from Bacillus subtilis by high-energy tandem mass Spectrometry [J]. Rapid Commun Mass Spectrom，2001，15：203-209.
[6]Tilvi S， Naik CG. Tandem mass spectrometry of Kahalaides： identification of new cyclic depsipeptides， kahlide R and S from Elysiagrandifolia[J]. Journal of Mass Spectrometry，2007，1：70-80.
[7]Chen H， Wang L， Yuan CHL， et al. Isolation and identification of lipopeptides produced by Bacillus subtilis using high performance liquid chromatography and electrospray ionization mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography，2008，26（3）：343-347.
[8]Yang SZ， Mu BZ， Lu YN， et al. MS Determination of the Sequence of Amino Acids in a Cyclic Lipopeptide[J]. Acta Chimica Sinica， 2004， 62（21）： 2200-2204.
[9]Raja A， LaBonte J， Lebbos J， et al. Daptomycin[J]. Nature Reviews Drug Discovery，2003，2：93-94.
[10]Shen S. Evaluation on Clinical Application of Cyclic Li-popeptide Antibiotics[J]. Evaluation and Analysis of Drug Use in Hospitals of China，2011，11（8）：677-679.
[11]Sivakumar B， Vijaysegaran P， Chaudhuri A， et al. Daptomycin Resistance in Prosthetic Joint Infections [J]. Case Report，2012，35（4）：603-606.
[12]Kamboj M， Cohen N， Gilhuley K， et al. Emergence of Daptomycin-Resistant VRE： Experience of a Single Institution [J]. Infect Control Hosp Epidemiol，2011，32（4）：391-394.
[13]Liu BN， Shi L，Jiang Q. Advance in cyclo-lipopeptide antibiotics[J]. Chinese Journal of Antibiotics，2007，32（9）：520-524.
[14]Kim K， Jung YS， Lee DK， et al. Suppression of inflammatory responses by surfactin， a selective inhibitor of platelet cytosolic phospholipase A2 [J]. Biochemical Pharmacology，1998，55：975-985.
[15]Kima SY， Kim JY， Kim SH， et al， Surfactin from Bacillus subtilis displays anti-proliferative effect via apoptosis induction， cell cycle arrest and survival signaling suppression [J]. FEBS Letters，2007，581：865-871.
[16]Vollenbroich D， Ozel M， Vater J， et al. Mechanism of Inactivation of Enveloped Viruses by the Biosurfactant Surfactin from Bacillus subtilis [J]. Biologicals，1997，25：289-297.
[17]Park SY， Kim YH. Surfactin inhibits immunostimulatory function of macrophages through blocking NK-κB， MAPK and Akt pathway [J]. International Immunopharmacology，2009，9：886-893.
[18]Tang JS， Gao H， Dai Y， et al. Progress on the studies of cyclic lipopeptides[J]. Acta Pharrm Sin，2008，43（9）：873-883.
[19]Stein T. Bacillus subtilis antibiotics： structures， syntheses and specific functions[J]. Mol Microbiol，2005，56（4）：845-57.
[20]Bie X， Zhaoxin L， Lu F. Identification of fengycin homologues from Bacillus subtilis with ESI-MS/CID [J]. Journal of Microbial Methods，2009，79：272-278.
[21]Cho SJ， Lee SK， Cha BJ， et al. Detection and characterization of the Gloeosporium gloeosporioides growth inhibitory compound iturin A from Bacillus subtilis strain KS03 [J]. FEMS Microbiology，2003，223：47-51.
[22]Hue N， Serani L，Laprevote O. Structural investigation of cyclic peptidolipids from Bacillus subtilis by high-energy tandem mass Spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom，2001，15：203-209.
[23]Vater J， Barbel K， Wilde C， et al. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in whole cells and culture filtrates of Bacillus subtilis C-1 isolated from petroleum sludge [J]. Applied and Environmental Microbiology，2002， 68：6210-6219.
[24]Gong M， Wang JD， Zhang J， et al. Study of the antifungal ability of Bacillus subtilis strain PY-1 in Vitro and identification of its antifungal substance （iturin A）[J]. Acta Biochimicaet Biophysica Sinica，2006，38：233-240.
[25]Madonna J， Voorhees KJ， Taranenko NI， et al. Detection of cyclic lipopeptide biomarkers from Bacillus species using Atmosphere pressure matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry，2003，75：1628-1637.
[26]Pyoung IK， Ryu J， Kim YH， et al. Production of biosurfactant lipopeptides iturin A， fengycin and surfactin from Bacillus subtilis CMB32 for control of Colletotrichum gloespriodes[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，20（1）：138-145.
[27]Williams BH， Hathout Y， Fenselau C. Structural characterization of lipopeptide biomarkers isolated from Bacillus globoigii[J]. Journal of American Society of Mass Spectrometry，2002，37：259-264.
[28]Price NPJ， Rooney AP， Swezey JL， et al. Mass spectrometric analysis of lipopeptides from Bacillus strains isolated fromdiverse geographical locations[J]. FEMS Microbiol Lett，2007，271：83-89.
[29]Yang SH， Wei DZ， Mu BZ. Determination of the structure of the fatty acid chain in a cyclic lipopeptide using GC-MS[J]. J Biochem Biophys Methods，2007，（70）：519-523.
（收稿日期：2014-01-03本文编辑：卫轲）
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（编号81373308、81172963）；十二五“重大新药创制”科技重大专项（编号2012ZX09301-002-001-018）；北京市自然科学基金资金项目（编号7133249）；中国医学科学院医药生物技术研究所中央级公益性科研院所基本科研业务专项（编号IMBF2012 04）；高等学校博士学科点专项科研基金新教师类项目（编号20131106120027）。
▲共同第一作者
[作者简介] 蒋忠科（1977.5-），男，四川中江人，博士，助理研究员，主要从事微生物药物及次级代谢产物的发现研究。刘少伟（1985.10-），女，河南开封人，博士，助理研究员，主要从事微生物药物及次级代谢产物的发现研究。
[通讯作者] 孙承航（1966.7-），男，浙江宁波人，博士，研究员，主要从事特境药用微生物资源勘探和新抗生素发现研究。
・医药资讯・
我国迫切需要制定心血管病防治战略规划
本刊讯（《中国医药导报》记者 刘志学） “中国不能盲从欧美指南；中国也从未像今天这样迫切需要符合中国国情、患情，并能指导中国心血管病防治的战略规划！”这是广东省医师协会会长林曙光教授在4月11日于广州召开的第16届中国南方国际心血管病学术会议上的呼吁。
据记者了解，2013年，美国推出了多项心血管病防治指南。与以往对美国指南一片赞誉不同，中国专家理性地发出了自己的声音：一方面对指南中值得借鉴的内容深入剖析，另一方面指出了不符合我国国情和临床实践的部分问题。
林曙光教授认为，“中国心血管防治面临严峻形势，但目前很多防治策略都盲目照搬西方指南，不符合我国国情。面对我国心血管病流行可能导致的灾难性后果，我们应把提升心血管病的防治水平提高到国家战略的高度，制定我国心血管病的防治战略。因为技术和临床救治只能拯救部分患者，而一个战略却能拯救整个国家。”
据介绍，我国心血管病现患人数为2.9亿，估计每年死于心血管病（包括心脏病和脑血管病）的有约350万人，占总死亡原因的41%，估计每10秒就有1人死于心血管病。据大会专家透露，近期，国家心血管病中心正牵头进行的心血管疾病关键治疗技术临床多中心研究信息平台建设，目标是建立我国急性心肌梗死、心力衰竭、心血管影像、心律失常介入治疗和冠状动脉旁路移植手术注册登记数据库系统，以了解我国不同区域、不同层级医院的诊治现况。
林曙光说，虽然我国公布的中国慢性病防治工作规划（2012-2015）是我国国家级的慢病防治规划，但心血管病的防治是个系统问题，涉及方方面面，包括人群层面、医生培养层面、急救层面和医疗质量管理层面，也应考虑到弱势人群、高危人群以及职业人群等。目前我国的一级预防和二级预防都存在严重不足，甚至缺失。可以说，从现在到2025年是我国应对心血管疾病挑战、实现医疗保健服务的战略转型期，急需从追求患病后甚至终末期的高成本生物技术，转向上游患病前的预防与健康促进。
鉴于上述情况，林曙光教授呼吁，要尽快结合我国的国情制定中国的心血管病的防治战略，这样才可实现国家心血管病防治水平的整体提高。
本文来源：http://www.zhuodaoren.com/shenghuo300116/
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