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NADPH,,,黄嘌呤氧化酶(一)
黄嘌呤氧化酶试剂盒
3. 组织XOD活力（U/gprot）=（测定OD值-空白管OD值）/呈色物摩尔消光系数×（反应液总体积/取样量）×（1/光径×反应时间）÷匀浆蛋白含量（gprot/L） 七、注意点：
1.试剂一、试剂四放-20℃保存，尽量避免反复冻融。
2.组织块要用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重后0℃以下可保存3个月以上。
3.血浆中XOD的检测：血浆在检测过程中容易引起混浊，需在测试前以3000-3500转/分，离心10分钟，小心吸取澄清的上清，弃去上层的脂肪与下层沉淀，若仍有混浊可反复离心。
产品简介：
产品编号 S0056
产品名称
谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒
产品包装 100次
产品价格 319.00元
谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(Cellular Glutathione Peroxidase Assay Kit)是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase)活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。 本试剂盒如果和总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)配合使用，可以定量检测出样品中不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
谷胱甘肽过氧化物酶可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂类过氧化物，从而消除自由基的毒害作用。
谷胱甘肽过氧化物酶几乎在所有组织中都有分布。在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显上调或下调。
谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。如果以过氧化氢为底物进行检测，则同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。本试剂盒利用了一种间接测定的方法。谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中，谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。
本试剂盒利用了如下的反应原理，GPx为谷胱甘肽过氧化物酶，GR为谷胱甘肽还原酶，R-OOH为过氧化物。
本试剂盒提供的有机过氧化物试剂(t-Bu-OOH)在没有谷胱甘肽过氧化物酶存在的情况下不会和GSH产生反应，也不会被细胞内的过氧化氢酶催化而分解。因而可以较为特异地检测出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。
由于t-Bu-OOH不能被不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶所催化，所以本试剂盒可以比较特异地定量检测最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
可检测组织匀浆产物、细胞裂解产物等样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活性。一个试剂盒可进行100次检测。 包装清单：
产品编号 S0056-1 S0056-2 S0056-3 S0056-4 S0056-5 S0056-6 —
保存条件：
谷胱甘肽还原酶4℃保存，其余-20℃保存，半年有效。NADPH溶解后宜-70℃保存，4℃可以保存一天，-20℃保存一周后NADPH会减少10%以上。GSH在配制成溶液后，适当分装，-20℃保存。 注意事项：
本试剂盒检测时牵涉到氧化还原反应，所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。如果在样品中的还原剂无法避免，例如DTT、巯基乙醇等，则这些还原剂的总浓度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。
常用的Triton X-100、Tween 20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，会影响本试剂盒的测定。如果必须使用这些去垢剂，最好使用纯度较高并注明含较低过氧化物的去垢剂。
为消除样品中可能含有的可以消耗NADPH的酶的干扰，可以检测不加过氧化物试剂的样品作为对照。 样品可以立即测定，也可以-70℃冻存待以后测定。 一定要严格控制反应时的温度，否则会引起较多误差。 NADPH不太稳定，要严格按照后续说明操作，谨防失活。
谷胱甘肽还原酶配制在接近饱和的硫酸铵溶液中，存放一段时间后容易出现硫酸铵结晶，属正常现象。室温孵育促进晶体溶解后可继续使用。如果有水分蒸发到管壁上，则需先离心，随后再促进晶体溶解。如果出现盖子未盖紧导致水汽泄漏的情况，则需补加蒸发掉的水量，然后再促进晶体溶解。可在晶体溶解后使用，但不溶解晶体直接使用也可以，此时可以使用的酶的总体积会稍稍减小一些。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
产品名称 样品匀浆液
谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液
谷胱甘肽还原酶
NADPH
还原型谷胱甘肽(GSH) 过氧化物试剂(t-Bu-OOH)
说明书
包装 100ml 50ml 40μl 5mg 14mg 200μl 1份
NADPH,,,黄嘌呤氧化酶(二)
新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶的变化
世界华人消化杂志 2004年 10月15日;12(10):2486-2487
新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶的变化
芦惠, 王丽杰, 中国医科大学附属第二医院儿科 辽宁省沈阳市 110004
项目负责人: 芦惠, 110004, 沈阳市和平区三好街36号, 中国医科大学附属第二医院儿
科. luhui66999@sina.com
电话: 024-23930619 传真: 024-83955509
收稿日期: 2004-07-20 接受日期: 2004-09-04
摘要
目的: 探讨新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶(XO)的变化.
方法: 新生大鼠随机分为对照组8只，实验组每一时相点各8只. 将E coli O55: B5脂多糖5 mg/kg 注入新生鼠胃内，分别于灌胃后3，6，12，24，72 h处死动物. 取部分肝组织固定，包埋，HE染色，光镜下观察其组织学改变. 其余肝组织用于测定XO活性.
结果: 实验组6，12 h XO活性明显高于对照组(分别为4 719±793 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g，4
929±477 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g，P <0.05); 3，24，72 h XO活性与对照组无显著差异(P <0.05). 内毒素治疗后随着时间的进行逐渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，空泡变性. 6，12 h可见大量肝细胞内出血，肝细胞坏死. 24，72 h肝细胞水肿渐消失，出血坏死不明显.
结论: 新生鼠肠损伤时可致肝脏受累，且XO活性愈高，肝损伤愈重.
芦惠, 王丽杰. 新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶的变化. 世界华人消化杂志 2004;12(10):2486-2487
0 引言
坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿期最常见的胃肠道疾病，可导致多器官功能衰竭[1]. 肝脏是人体重要的免疫器官，在肠屏障功能受损时，作为第一道防线，一定程度上能抑制肠源性感染扩散，但其本身炎性细胞也可被激活，在倍增全身炎症反应的同时自身亦受到损伤[2].我们通过内毒素(lipopolysaccharide，LPS)建立新生鼠肠损伤模型，探讨肝脏黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)的变化及意义.
1 材料和方法
1.1 材料 健康1日龄Wistar新生大鼠，平均体质量6.3±0.9 g
供. 随机分为对照组8只，实验组每一时相点(3，6，12，24，72 h)各8只. 将1.9F硅胶管Sandy，UT，USA)经口插入胃内，E coli O55: B5脂多糖(LPS;Sigma Chemical CO．，St．Louismg/kg用无菌生理盐水稀释至0.2 mL注入胃内; 对照组则注入无菌生理盐水0.2 mL[3]. 灌胃后各组均放回母鼠旁，继续哺乳，直至实验结束.动物处死后，分离肝脏.取肝组织于40 g/L多聚甲醛中固定，常规脱水，包埋切片，行HE染色，光镜下观察其组织学变化. 其余肝组织于－80 °C超低温冰箱中保存，以备检测.
1.2 方法 肝组织XO活性测定，按测定试剂盒要求，应用紫外/可见分光光度计(法国500-P型)，测定肝组织匀浆XO活性. 同时按考马斯亮兰蛋白测定试剂盒说明测定每一样本的蛋白浓度. 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.
统计学处理 经SPSS 11.5 For Windows数据分析软件处理. 所有数据以mean±SD表示，组间比较采用配对t检验. 统计结果显著性以P <0.05表示.
2 结果
2.1 肝组织XO活性变化 实验组6，12 h肝组织XO活性(4 719±793 nkat/g，4 929±477 nkat/g)均明显高于对照组(3 961±387 nkat/g，P <0.05)，高峰在12 h; 24 h (4 481±473 nkat/g) XO活性下降，3(4
268±455 nkat/g)，24，72 h (3 994±605 nkat/g)肝组织XO活性与对照组无显著差异(P >0.05).
2.2 肝组织形态学改变 对照组新生鼠肝小叶分界不清，肝板排列较成年大鼠差，胞质嗜碱性，门管区不清楚，但中央静脉清晰可见. 内毒素治疗后随着时间的进行，逐渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，空泡变性. 6，12 h时可见大量肝细胞内出血，肝细胞坏死. 24，72 h时肝细胞水肿渐消失，出血坏死不明显.
3 讨论
NEC多见于新生儿. 早产、缺氧/缺血、肠道喂养和细菌增生是导致此病的主要危险因素[1,3-5]. 临床统计，80％以上的NEC患儿是早产儿或低出生体质量儿，其发病率与胎龄呈负相关[6-8]，原因是早产儿肠道免疫功能不成熟. 胃肠道免疫功能分为非特异性(先天性)和特异性两部分，前者包括胃酸、蛋白水解酶、粘蛋白及通透性等[9]. 生理功能完整的肠黏膜对细菌和内毒素构成屏障作用; 在感染和创伤等应激状况下，肠屏障受损，大量细菌和毒素经门静脉和肠系膜淋巴系统进入体循环，导致肠源性内毒素血症和细菌移位，并可引发炎症连锁反应，引起全身炎症反应综合征，最终致多器官功能衰竭(MOF)[2]. 因此有人称肠道为“创伤后多器官功能衰竭的源泉”. NEC亦可导致多器官功能衰竭.
新生鼠非特异性免疫功能缺陷[3]，我们发现，在肠道给予LPS后肝组织渐出现中央静脉扩张，肝窦充血、炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞质疏松，肝细胞出血、坏死等自身受损的表现. LPS可增加肠黏膜通透性、改变肠动力、降低肠防御机能、损害肠上皮细胞紧密连接从而促进肠道细菌移位. 而肝脏是人体的主要代谢器官，也是重要的免疫器官. 生理条件下，肝肠形成肠肝轴(enterohepaticaxis)，发挥多种生理功能. 在肠屏障功能受损时，LPS进入循环系统，则肝脏炎性细胞可被源自肠道的细菌和毒素激活，出现肝细胞坏死[3,10].
活性氧
. 黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶
XD/XO)系统是肝脏ROS的主要来源[11]. XD是XO的前体，. 不同的是XD需NAD+作为电子受体，产生稳定的活性产物NADPH; 而XO则以分子氧为电子受体，产生高活性超氧阴离子(O.2-)和过氧化氢(H2O2). 正常情况下，XD占酶活性的90%，仅10%以XO形式存在. 主要参与核酸的分解代谢; 促进肠道对铁的吸收和转运; 而且，当细菌或毒素侵袭导致毛细血管内皮轻微受损时，XD从血管内皮细胞释出，在有氧环境中转变为XO，在催化底物过程中产生O2-，对机体具有防御功能[12-13]. 但在缺血/再灌注或感染时，细胞内ATP分解过度，ATP不足使钙泵活性下降，细胞内Ca2+浓度升高，激活钙依赖蛋白酶，促使XD向XO转化，XO活性显著增加，ROS代谢产物亦增加. 介导脂质过氧化反应，使膜受体、蛋白酶和离子通道的微环境发生改变，导致细胞功能障碍，甚至死亡[10-12]. 我们发现，经LPS治疗后，肝组织XO活性愈高，肝损伤愈重. 72 h时XO活性降低，肝细胞水肿消失，出血坏死不明显.提示临床如能应用XO抑制剂有效减少活性氧的产生，对于新生儿NEC
的整体治疗可能具有一定意义.
4 参考文献 an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res 2004;55:622-629 dysfunction in critical
illness. Curr Opin Crit Care 2003;9:143-151
ages: a possible
Dis 2003;16:349-355
enterocolitis: clinical
considerations and pathogenetic concepts. Pediatr Dev Pathol 2003;6:6-23 enterocolitis. Saudi Med J
2001;22:231-237 459 birth-weight neonates.
Cochrane Database Syst Rev 2004;1:CD001816 694
oxidase. FEBS Lett 2004;562:129-133
NADPH,,,黄嘌呤氧化酶(三)
氧自由基
第五章 自由基清除剂
本章要点
1. 自由基理论的产生机理及来源
2. 自由基对机体活动的影响
3. 自由基清除剂的基本概念
随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。
自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。
近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。
第一节 自由基理论
一、自由基的产生机理及来源
自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。
人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自
－－由基包括超氧阴离子（O2·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2·）、烷过氧基
－（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO）、氢过氧化物（ROOH）和单
线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。
（一）自由基的产生
人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自由基在扩展阶段没有消失或增加，那么反应中就有几条链。随着反应的进行，体系中的反应物浓度越来越【NADPH,,,黄嘌呤氧化酶】
低，自由基相互碰头的机会越来越多，反应速度就越来越慢，自由基越来越少，最后反应停止。由此可见，自由基反应动力学有别于普通的分子反应，自由基可以连续传递而出现连锁反应。
过氧化物作为引发剂可以使反应在较低温度下进行，如果反应体系中有自由基清除剂存在，它就能很快地捕捉自由基使扩散不能形成。活性强的自由基清除剂能阻止连锁反应的开始。因为氧分子与许多有机物反应时产生自由基，而自由基清除剂能捕捉过氧自由基而中断连锁反应，阻止有机物的氧化，所以自由基清除剂又称为抗氧化剂。
（二）自由基的来源
人体内特定的自由基有不同的来源。
－超氧阴离子自由基（O2·）在其中扮演着非常重要的角色，因为在反应顺序上其他许多活性中间产物
－的形成都始于与 O2·起作用。它是从黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶通过酶的一电子还原作用释放的氧
－产生的或由呼吸链裂解生成的。人体利用的氧气中约有1%～3%转化为O2·。
过氧化氢分子（H2O2）也是一种重要的非自由基活性物，容易在活细胞中扩散。过氧化氢酶能有效地将其转变成水，生成氧自由基。
羟自由基（OH·）的活性最强，其半衰期估计为10-9秒，其产生后能迅速起反应。在射线等高能辐射下，通过体内水的均裂作用或经金属催化过程由内源的过氧化氢分子形成。紫外线能将过氧化氢分子分裂成两个羟自由基分子。
过氧基自由基的半衰期比较长，可达数秒，在生物系统中扩散的途径相当长。在脂质过氧化过程中，从多不饱和脂肪酸去掉一个氢原子开始，能形成过氧基自由基。羟自由基能启动这一反应过程。
脂质过氧化作用进一步产生烷氧自由基（RO·）和有机的氢过氧化物（ROOH），后者可能重排成为内过氧化物中间产物，然后分裂产生乙醛。
单线态分子氧（1O2）是另一种非自由基的活性物，可能是体内的组织暴露于光中形成的。其半衰期估计为10-6秒，具体时间取决于周围基质的性质。它能通过转移其激发态能量或通过化学结合与其它分子相互作用。单线态分子氧优先发生化学反应的靶为双键部位。
氧化氮自由基（NO·）也是一种很重要的自由基，它是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物，能松弛血小管平滑肌，防止血小板的凝集，从而降低血压。也可通过激活参与初级免疫的巨嗜细胞而产生。它的半衰期为6～50秒，很容易与氧发生反应，反应产物NO2也是自由基。它还能与生物分子直接反应或
－－与O2·结合形成过氧亚硝酸盐（ONOO）。NO·过多会产生细胞毒性。
二、自由基对机体生命活动的影响
自由基是体内各种生化反应的中间代谢产物，在人体的生命活动过程中，各种生化反应，不管是酶促反应还是非酶促反应，都会产生各种自由基。从自由基的化学结构可以看出，它含有未配对的电子，是一类具有高度化学活性的物质。在正常的情况下，体内自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中，并在代谢中发挥着重要作用，参与一些酶和前列腺素的合成，增强白细胞吞噬活性，提高杀菌效果等。但是，如果自由基过多或清除过慢，则会对人体造成严重危害。
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