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Treg与肿瘤细胞混合培养(一)
肿瘤分子生物学复习资料
1. 肿瘤流行病学：
研究肿瘤在人群中分布和影响因素，探索各种不同肿瘤的病因和危险因素，以制定相应预防和控制措施，并对这些措施加以评价，可以用四个词概括：Distribution、Etiology、Prevention、Evaluation。
2. 肺癌的危险因素和保护因素：
（1）.危险因素：
吸烟、新鲜蔬菜摄入少、呼吸系统疾病、低体质指数、心理因素、厨房油烟、大气污染、遗传易感性。
（2）.保护因素：
新鲜蔬菜水果、醋、葱蒜、辛辣食品、经常参加体育锻炼、饮茶、常吃奶及奶制品和蛋类、β-胡萝卜素、维生素E、膳食纤维。
3. 肝癌危险因素和保护因素
（一）.危险因素：
（1）.生物学因素：
病毒（病毒性肝炎）、细菌（黄曲霉毒素）、寄生虫（肝吸虫）；
（2）.化学因素：
饮水污染、吸烟、饮酒、有机溶剂、药物（癫痫药物、降压药、避孕药、解热镇痛药、激素类药物）；
（3）.营养因素：油炸食品、非新鲜水果、腌制食品、高脂高盐食品；
（4）.社会心理因素：抑郁、精神压力
（5）.遗传因素.
（二）.保护因素：
饮绿茶、新鲜蔬菜、无油烟、接种乙肝疫苗。
4. 癌基因及激活机制：
（一）.癌基因：
细胞中固有的一类基因，正常情况下参与细胞增殖与分化的调控，当基因结构和功能发生变异，能促使正常细胞发生恶性转化。 激活机制：（1）基因点突变（主要活化方式）：单个碱基替换
（2）DNA扩增：原癌基因数量增加或表达活性增强；
（3）染色体易位重排：原癌基因可能移至强启动子或增强子附近被激活
（4）癌基因甲基化改变：发生低甲基化改变，导致癌基因或相关因子大量表达。
（5）获得启动子与增强子，基因过量表达
（二）.抑癌基因：
即肿瘤抑制基因，是指一大类可以抑制细胞分裂，并有抑制癌变作用的基因，在特定条件下失去正常功能而导致肿瘤发生。 失活机制：
（1）.基因突变:
重要方式。点突变、无义突变、插入突变和缺失突变。
（2）.纯合性丢失：
等位基因丢失，导致编码的功能蛋白不能表达；
（3）.杂合性丢失：
指细胞有丝分裂异常导致一个与突变基因对应的正常等位基因丢失。
在肿瘤发生过程中，抑癌基因一个等位基因首先因某些原因失活，另一个等位基因被同源染色体复杂拷贝取代、突变、缺失等失活，成为纯合子而失去功能。
（4）.抑癌基因产物通过与癌基因产物相结合而失活。【Treg与肿瘤细胞混合培养】
5.P53基因的功能：DNA结合功能、调控细胞周期、DNA修复、调控细胞凋亡、参与细胞分化和基因可塑性调控。
（1）.调控细胞周期：作用于细胞周期的G1、G2/M和G0等checkpoint。
（2）.与DNA结合，调节转录。
P53蛋白诱导P21蛋白，并以此蛋白为介质，抑制细胞分化和增殖，P53蛋白控制细胞从G0到G1期转变，并在G1期生长限制位点控制细胞进入细胞周期后的增殖。
（3）.细胞损伤时，引发凋亡起到抑癌作用。
（4）.P53基因突变可能导致细胞无限生长。
6.G protein
即GTP binding protein。【Treg与肿瘤细胞混合培养】
与膜受体偶联的三聚体G蛋白，由α、β、γ三种亚基组成，当受体未与配体结合时，三个亚基呈聚合状态，此时α亚基与GDP结合，无活性。
当受体与配体结合时，GTP取代GDP与α亚基结合，G蛋白被激活，随之解聚成Gα-GTP和Gβγ两部分，并且不再与受体结合。 通常Gα-GTP结合并激活/抑制质膜中某种酶，再由这种酶催化产生第二信使。之后Gα把与之结合的GTP水解成GDP和Pi，Gα失活，重新与Gβγ亚基结合，形成无活性的G蛋白。
7.第二信使
相对于细胞外信号分子（第一信使）而言，第一信使与受体作用后在细胞内最早产生的信号分子称为第二信使。目前公认的有：cAMP、cGMP、IP3、DG和Ca2+。
8.受体酪氨酸激酶（RTK）
细胞内具有酪氨酸激酶活性的跨膜结构的酶蛋白受体。
其胞外区与生长因子配体结合，然后激活胞内段的酶活性区，启动信号转导，参与细胞生长、增殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成。如EGF、PDGF等细胞膜上生长因子受体。
9.MAP kinase cascade
MAPK级联系统是细胞适应外界环境变化的一种非常重要的调控机制。由3种蛋白激酶组成MAPK、MAPKK、MAPKKK。上游因子→激活MAPKKK，发生磷酸化→MAPKK，磷酸化→MAPK活化下游转录因子，调节基因转录。把外界信号一级一级传到细胞核，使细胞做出应答。参与细胞生长、发育、分裂及细胞间功能同步及细胞恶性转化。
10.FAK Focal Adhesion Kinase
一种非受体型胞浆酪氨酸激酶，有胞内第一信使之称，FAK属于
看家基因，是Src癌基因底物，是一个高度磷酸化蛋白，参与细胞黏附、铺展、增殖、迁移及凋亡。
11.细胞信号传导的基本概念、过程和特征
（1）.概念：把细胞外信息转化为细胞内信息并诱导基因表达改变和细胞代谢途径改变，从而使细胞对外界环境做出改变的过程。
（2）. 特征：受体+受体后信号通路+作用终端
细胞信号通过受体或类似于受体的物质激活细胞内信号通路，触发离子通道开放、蛋白质可逆磷酸化反应等变化，进而导致一系列生物效应。不同的信号通路之间有相互联系和作用，形成复杂网络。
（3）.过程：
1）.G蛋白偶联受体介导的信号转导
受体+配体→受体活化→GTP取代GDP同G蛋白结合→G蛋白分离（Gα-GTP、Gβγ）→G蛋白与受体分离→Gα-GTP结合并激活或抑制某种酶→产生第二信使。
产生第二信使主要有两条途径：
② cAMP途径：G蛋白作用于腺苷酸环化酶，调节cAMP产生。 ②IP3、DG和Ca2+途径
G蛋白作用于磷脂酶C(PLC)→IP3和DG→内质网释放Ca2+
2）酶偶联受体介导的信号转导
12.磷脂酰肌醇衍生的主要第二信使及其在信号转导途径中的作用：
（1）.DAG甘油二酯：
Treg与肿瘤细胞混合培养(二)
生物治疗发展和方向
生物治疗进展和方向
一、生物治疗基本原理
生物治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，主要是运用生物技术和生物制剂对从患者体内采集的免疫细胞进行体外刺激、活化并大量扩增后回输到患者体内，以达到治疗肿瘤的目的。目前，生物治疗已经成为继手术、放疗和化疗之外的第四种肿瘤治疗技术，受到了越来越多的临床医生，患者和家属的认可。肿瘤患者的自身免疫系统往往不识别肿瘤，被肿瘤自身或诱导产生的大量免疫抑制信号所抑制，因此，体外培养的细胞在解除肿瘤免疫抑制的情况下会很快恢复原有的功能。经过细胞因子的刺激，回输到患者体内后，在治疗肿瘤的同时，也激活了机体的免疫功能，提高患者的生活质量。
二、CIK细胞特点和临床应用
具有更为广谱的杀伤肿瘤作用，并且毒副作用小，无严重不良反应。它适应于治疗中、晚期发现的肿瘤。
近年来, 肿瘤的过继免疫治疗已渐渐成为肿瘤的生物治疗中最活跃的研究领域之一。在继淋巴因子激活的杀伤细胞( LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和 CD3McAb 激活的杀伤细胞(CD3AK)之后, 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)以其更高的增殖活性和更强的细胞毒活性越来越多的被人们所研究利用。20 多年来, 经过反复的体外实验, CIK 细胞已经作为手术、放疗和化疗等传统肿瘤治疗手段的重要辅助方法进入了 I、II 期临床试验阶段。CIK细胞具有广谱的杀伤肿瘤作用，无严重不良反应。它适应于治疗中、晚期发现的肿瘤。尤其是对脑胶质瘤、前列腺癌、胃肠道癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌等均有疗效。
应用CIK细胞治疗肿瘤的I期Ⅱ期临床试验都显示，CIK细胞能有效地抑制和杀灭肿瘤细胞且没有不可耐受的副作用，特别是对于手术后病人，清除微小转移灶，防止癌的扩散和复发，提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。临床治疗还显示CIK细胞治疗胸、腹水患者，控制和排除胸、腹水，杀灭胸、腹水中的癌细胞有良好的效果。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可以起到改善生活质量，延长生命的积极作用。
三、DC-CIK的出现和优势
DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，也可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。
DC-CIK细胞是将负载肿瘤抗原的DC细胞与CIK细胞共同培养后，DC细胞会提高了CIK细胞的增殖速度和杀伤活性，增加CIK细胞的细胞因子分泌能力，且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。所以负载肿瘤抗原的DC细胞与CIK的有机结合能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应，提高CIK细胞的抗肿瘤能力，改善临床疗效。
四、一般生物治疗适应人群
根据生物治疗的特点，合理使用生物治疗是确保患者临床最大获益的保证。对以下几类患者来说，进行生物治疗并临床获益的概率较大。
①早期的肿瘤患者：手术切除肿瘤后的一周左右是生物治疗最好的时期，因为这时原始病灶已被拿掉，身体肿瘤负荷最低。免疫细胞可以充分发挥清扫残余肿瘤细胞的作用。利用DC-CIK细胞可有效控制肿瘤的发展，直至全部杀灭肿瘤细胞，防止肿瘤转移与复发。②放化疗患者：生物治疗能增强放疗敏感性、减少毒副作用;抵抗化疗药物的免疫抑制作用，增强对化疗药物的敏感性，从而提高化疗的疗效，迅速缓解患者的临床症状，大部分患者可达到瘤体缩小甚至消失、或长期带瘤生存的效果。放疗同样可结合生物治疗同步进行，二者相辅相成，可提高疗效。合理的联合应用可提高患者对治疗的临床反应，而对于放化疗无效的患者，同样可以采用生物治疗延长生存期。③晚期和无法进行放化疗的患者：由于肿瘤生物治疗具有免疫调节和自体细胞修复作用，在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，都会出现消化道症状减轻或消失，精神状态和体力亦有明显恢复。即使是对于晚期肿瘤、已发生转移、体质较弱的患者，进行生物治疗也具有控制肿瘤的转移和复发的作用，为患者延长生存时间，提高生存质量。
五、针对生物治疗的缺点，目前进展
生物治疗具有传统肿瘤治疗手段所不具有的优点，但是由于其临床疗效往往比较缓慢，不够直接，通过一般的肿瘤评估标准，并不能真正的反应生物治疗给肿瘤患者带来的变化，这也是限制生物治疗的主要原因。因此，大量的基础工作者都在积极寻找提高生物治疗疗效的方法，解决过继细胞免疫治疗的靶向性、持续性以及克服免疫抑制环境的关键机制。
六、CART的出现
CART细胞是在T细胞的基础上，利用基因工程的方法，将针对肿瘤特定抗原的单克隆抗体的单链可变区scFv连同共刺激信号和CD3zeta等组合到一起，通过病毒感染T细胞的
方式，将基因整合到T细胞DNA中，并通过蛋白的翻译，表达到T细胞表面。根据抗原抗体反应的原理，使T细胞可以高效特异性的识别表达有相应肿瘤抗原的肿瘤细胞，从而完成对肿瘤细胞的杀伤。相对于传统细胞治疗，CART细胞具有明显的肿瘤特异性，同时疗效更加迅速直接。
已开展的CART细胞临床研究中，取得最佳反应的是在血液系统肿瘤中，如白血病和淋巴瘤，但在实体瘤中还缺乏明显的突破，这可能是由于实体瘤复杂的肿瘤微环境抑制了CART细胞的功能，目前已有多项临床研究结合CART和克服肿瘤微环境的项目正在开展。
CART细胞的临床应用，伴随着临床疗效的是严重的毒副作用，主要包括以下几点：①细胞因子释放综合征：当CART细胞与带有靶向抗原的肿瘤细胞相遇后，除了直接的接触性杀伤之外，还会释放大量的细胞因子，不同的研究机构报道的不尽相似，但是多数报道主要集中在IL-6，IL-2和IFN-γ的大量升高，一旦发生细胞因子释放综合征，将会发生多种多样的严重临床症状。对此，临床一般使用相应的抗体药物控制反应，如托珠单抗。②脱靶毒性：由于肿瘤高表达的抗原往往在正常的组织细胞中也有表达，所以伴随着CART细胞的输注，对正常组织的脱靶毒性将不可避免。以目前开展较多的CAR-19临床反应为例，B细胞缺乏将伴随着患者很长的时间，直到CART细胞消失。③溶瘤综合征：由于CART细胞对肿瘤的高效杀伤能力，当CART细胞与肿瘤细胞接触后，会导致肿瘤细胞的大量崩解，释放出众多的细胞内容物和代谢产物，进入血液后会导致大量的高尿酸症，低钙血症，高钾血症等临床症状。④过敏反应：目前由于抗体可变区scFv大多数都是鼠源的，所以免疫原性较强，输入人体后，往往会造成机体对CART细胞的快速清除，导致之后输注的CART细胞发挥的作用有限。④神经毒性：有不少研究人员发现，CART细胞的输注往往会给患者带来可逆的神经系统毒性，因此对于有相关系统疾病的患者因提前规避，如癫痫患者。⑤其他的毒性：在临床中，CART细胞治疗是个体化治疗，所以发生相关毒性具有不确定性，临床可控性较差，因此配备具有较深厚的临床经验的医生是保证临床试验顺利开展的必要保障。
CART在实体瘤中进展缓慢，可能的原因有以下两点：①实肿瘤实质的结构较致密，CART细胞很难突破肿瘤周围大量的MDSC和纤维细胞；②肿瘤微环境中的免疫抑制因素太多，除了Treg等免疫抑制细胞之外，肿瘤细胞高表达PD-L1，分泌IDO等免疫抑制因子诱导浸润的T细胞无能。此外，最近文献报道CART细胞治疗复发后的患者，往往表现为相关靶向抗原转为阴性，导致CART细胞失去靶向肿瘤细胞的作用，因此多靶点联合将会是CART的另一个发展方向。
七、关于细胞治疗的其他方向
基于T细胞为基础的临床研究，目前除了基因修饰（CART）方向之外，还有其他方向，主要包括①CIK联合不同化疗方案的联合。设计原理是不同的化疗方案，除了对肿瘤细胞的直接杀伤之外，对血液中的很多免疫抑制性因素也有不同影响，例如不同化疗方案对免疫抑制性细胞Treg和MDSC的选择性清除，可以降低肿瘤患者体内的免疫抑制因素，为CIK细胞发挥临床疗效保驾护航。相反CIK细胞的回输会提高肿瘤患者的免疫力，减轻化疗副作用，提高对治疗的耐受。②CIK细胞联合不同剂量的放疗。设计原理是放疗对肿瘤局部的破坏会导致肿瘤微环境的改变，同时肿瘤抗原的释放会激发自体的免疫反应，促进CIK细胞进入肿瘤局部，杀伤肿瘤细胞。③CIK细胞与PD-1/PD-L1抗体的联合使用。设计原理是肿瘤微环境中大量的免疫抑制因素会诱导进入其中的功能性的CIK细胞杀伤功能沉默，变为无效能的细胞，失去杀伤肿瘤的功能。而PD-1/PD-L1通路是肿瘤抑制T细胞功能的关键点，所以解除该关键点的抑制，可以确保CIK细胞的功能，增加临床反应性。④表观治疗。肿瘤的恶性程度与其甲基化程度息息相关。通过表观治疗可以降低肿瘤及其微环境中相关基因的甲基化水平，从而改善免疫抑制环境，同时表观治疗可以提高肿瘤相关基因的表达，如EGFR等，使T细胞更加容易识别相关抗原，提高临床反应。
八、目前开展临床新项目的困难之处
欠缺基础科研仪器：凝胶成像系统，核酸和蛋白电泳设备，荧光显微镜，病毒等操作的生物安全柜，低温高速离心机，常温低速离心机，-80℃冰箱，液氮罐，4℃冰箱，-20℃冰箱，细菌扩大生产的摇床以及检测核酸浓度的仪器设备等。
实验空间来说：除了GLP实验室和仪器之外，还需要开展基础研究的平台，包括①细胞学实验单独的房间，设备需要细胞培养温箱和生物安全柜以及离心机和冰箱 ②细菌室做基因克隆等分子生物学实验，设备需要生物安全柜，摇床以及冰箱 ③病毒操作需要单独的生物安全柜和细胞培养箱以及冰箱、低温高速离心机和低速离心机等。为设计的合理，空间太小可能也不方便不同实验的进行。另外其他的分子生物学实验，不同的仪器需分别配备不同的空间，例如电泳室和凝胶成像系统需独立空间，荧光显微镜等设备根据体积等的不同，都需要有一定的空间，其他的是需要固定的试验台空间，放置常用试剂并操作分子生物学实验，如提质粒，PCR等常规实验
人员配置：中心实验室，科研项目的开展，需要不同层次和方向的人才配置。在确定科室整体研究方向初期，技术人员的优势互补是关键。个人觉得依托于细胞治疗平台，开展相
关可快速转化为临床应用的研究方向是科室长盛不衰的根本，希望科研引进几位分子生物学、免疫、基因工程和细胞生物学方面的人才，构成一个可全面发展的团队。
Treg与肿瘤细胞混合培养(三)
肿瘤学名词解释
1. T-regs(Regulatory cells): 调节性T细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，早期亦称做
suppressor T cells。可分为天然产生的自然调节性T细胞（n T-regs）和诱导产生的适应性调节性T细胞(a T-regs或i T-regs)，如Th3、Tr1，另外尚有CD8 Treg、NKT细胞等，可分泌TGF-B,IL-4等多种细胞因子，与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。
2. DC(Dendritic cells): 树突状细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，它能高
效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
3. BSC(Best Supportive Care): 早期肿瘤患者科研通过手术和术后辅助治疗等综合治疗手段获得治愈疗效，这
一阶段的支持治疗称为最佳支持治疗。其目的是运用多种治疗手段最终治愈癌症。主要内容包括肿瘤相关症状的控制、抗肿瘤治疗合并症的处理、整体治疗结束后的康复治疗。
4. EGFR(Epidermal growth factor receptor):表皮生长因子受体，属于酪氨酸激酶型受体，其家族包括
HER1-4）。广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。
5. MTD(Maximum tolerated dose)：最大耐受剂量，又称最大耐受浓度。指药物在除急性毒性动物实验外的实验
(短期重复实验、亚慢性毒性实验、慢性毒性实验)中不引起实验动物死亡的最大剂量或浓度。
6. DD
7. IGRT(Imaged-guided stereotactic radiotherapy)：影响引导放射治疗一种四维的放射治疗技术，它在三维放
疗技术的基础上加入了时间因数的概念，充分考虑了解剖组织在治疗过程中的运动和分次治疗间的位移误差，如呼吸和蠕动运动、日常摆位误差、靶区收缩等引起放疗剂量分布的变化和对治疗计划的影响等方面的情况，在患者进行治疗前、治疗中利用各种影像设备对肿瘤及正常器官进行实时的监控，并能根据器官位置的变化调整治疗条件使照射野紧紧“追随”靶区，使之能做到真正意义上的精确治疗。
8. IMRT(Intensity modulated radiation therapy): 调强适形放射治疗是三维适形放疗的一种，要求辐射野内剂
量强度按一定要求进行调节，简称调强放疗。它是在各处辐射野与靶区外形一致的条件下，针对靶区三维形状和要害器官与靶区的具体解剖关系对束强度进行调节
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