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热休克蛋白60骨骼(一)
第四章 热休克蛋白与免疫
第四章 热休克蛋白与免疫
(Heat Shock Protein and Immunity)
一、概 述
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一类具有重要生理功能，参与免疫应答的高度保守的蛋白质分子大家族。根据其分子量大小和同源程度，可将其分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP等几个家族。生理、病理(如创伤和感染)及环境因素(如温度突然升高)等都可诱导一切生物细胞包括原核细胞和真核细胞产生HSP，又称应激蛋白(stress protein，SP)。
HSP的生物学功能广泛，不仅表现在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象，保护细胞生命活动，以确保细胞生存，而且在蛋白质折叠、跨膜运输、转位、细胞骨架及核骨架稳定等基本功能方面发挥重要作用，以调节这些蛋白质的活性和功能。HSP自身又不参与大分子蛋白质的组成，又被称为“分子伴侣”(molecular chaperon)。
最先发现HSP的是Ritossa(1962年)，他观察到正常果蝇暴露于高温，发生休克后，其唾液腺染色体变得疏松膨胀，对此现象的发生原因，他未能作深入的研究。12年后，Tissieres等(1974年)证实，增高温度时果蝇染色体蓬松是由热休克激发染色体内基因转录合成特异蛋白质引起的，遂将该蛋白称为热休克蛋白(HSP)。
Nover(1984年)与Soger等(1987年)先后阐明编码这种蛋白质的基因序列、基因结构及位点，如编码HSP70的基因在人类MHC基因位点图上介于补体成分基因与肿瘤坏死因子(TNF)基因之间；在大鼠，则靠近MHC-Ⅲ类抗原基因，在小鼠，HSP84基因与MHC连锁。 除了温度刺激以外，还发现其它一些有害的理化因素，如氧化剂、重金属、乙醇或代谢抑制物等亦可促使HSP的合成增加。在机体遭遇组织损伤、病原体感染、炎症或遇有某些细胞因子(IL-1、IL-2、TNF、IFN)的刺激，皆会伤害细胞，使其蛋白质构型发生改变及功能消退，从而引起细胞的应激反应，诱导机体某些细胞合成HSP，以保护细胞和对抗有害因子。 Ames等(1986年)及Filds等(1986年)分别用小剂量H2O2预先处理能高表达HSP、细胞
内感染的鼠伤寒沙门氏菌，使其合成HSP，结果能耐受致死量H2O2或高热度攻击而不死；另
一方面用同量的H2O2预先处理缺乏HSP基因表达的感染该菌的变异株，随后用高剂量的H2O2或热攻击，结果病原体和感染细胞皆失活，因缺乏产生HSP之故。
Srivastava(1996年)从甲基胆蒽诱发的小鼠纤维瘤细胞上分离得到HSP70，并证实可作为一种肿瘤转移性抗原诱发宿主的抗肿瘤免疫反应。Tamura等(1993年)也在H-ras转化的小鼠纤维肉瘤细胞W31上证实其表达HSP70，并发现一种CD8-CD4-双阴性T细胞介导了HSP70诱发的抗肿瘤免疫反应，这种CD8-CD4-双阴性T细胞后来被证实为γδT细胞。近年来证实HSP及其相关复合物是γδT细胞能识别的配体。
近十几年来，发现某些HSP具有分子伴侣作用后，HSP研究工作产生了一次飞跃，成为目前生命科学的热点课题。
HSP广泛分布于生物界，在动物、植物、微生物及人类中普遍发现了HSP，其功能也是多种多样的。
二、HSP的分类
(一) HSP分类的依据
HSP按其同源程度及分子量大小可分为，HSP110家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、小分子HSP家族及泛素(ubiquitin，Ub，广泛分布于细胞浆及细胞核的小分子蛋白，有结合DNA的功能)家族。
分类方法是将放射性核素标记的各种必要氨基酸加入拟检测的细胞群中，进行温育、加热或应激处理，作SDS-PAGE电泳分离，以放射自显影进行检测和鉴定，根据生成的蛋白质的分子量，以千道尔顿(kD)单位对HSP命名，如HSP60，即此种HSP的相对分子量为60kD。由于不同细胞产生的各个家族HSP及其成员间常有40%-70%以上的序列同源，必要时需以Western blot做进一步鉴定。
(二) HSP家族及其成员
用上述方法可将HSP分为不同的家族及成员，具体见表4.1。
表4.1 HSP的家族、成员及其主要功能 家族 主要成员 主要功能 HSP90 HSP90 阻止类固醇受体结合至DNA，酪氨酸激酶磷酸化
HSP87 HSP84HSP83 肿瘤防护及自身免疫性
HSP70 蛋白质折叠、去折叠、转运、多聚复合体装配
gRP80 Ig装配，MHCⅡ类抗原处理，多种病原体抗原，自身免疫性
gRP78 蛋白质折叠、去折叠、多聚复合体装配
HSP70 PBP72/74 多种病原体抗原，自身免疫性
HSP70、HSP60、HSP65、HSP60蛋白质降解
HSP58 GroEL MHCⅠ类抗原处理
小HSP HSP35、HSP28、HSP27、HSP25、HSP22、Ub 淋巴细胞归巢，自身免疫性 注：①PBP72/74是由HSP70派生的肽结合蛋白(peptide binding protein)；②BiP(binding protein)是结合蛋白，主要结合Ig重链进行装配；③HSC(heat shock potein cognat)，指组成型HSP70；④GroEL相关蛋白是Q热、梅毒、结核、麻风等许多微生物感染的主要抗原。
一个家族的成员，除分子大小相似外，还具有一些共同特征。
不同种属生物有相似的HSP家族。
在系统发育中，某一特定家族的氨基酸顺序与功能极为保守，同源性上可达50%以上，例如分枝杆菌的HSP65与大肠杆菌的HSP65在其296位-420位氨基酸残基片段有65%的序列同源，用单抗检测也有明显的交叉性反应，表明两者抗原性相似。
三、HSP的特性
(一) 氨基酸组成的保守性
HSP是由一些核内基因编码的保守蛋白质，在生物界进化中，是最保守的组成成分。已知人体细胞与细菌等原核细胞，在生物种系进化史上相距至少约15亿年，但是迄今它们受热休克或应激诱导产生的HSP都有显著的同源性(hamology)，即相差极大的不同种生物细胞产生的这类蛋白，分子序列大部分都相同或类似，例如由各种分枝杆菌产生的HSP65与由人细胞、寄生虫及其他细菌产生的HSP65，用Western blot检测有50%以上的氨基酸序列同源，用McAb检测有明显交叉反应，它们之间有相同的抗原性，表明HSP是进化最保守的蛋白质。
(二) 诱因的多样性
除热刺激外，其它能引起细胞或机体应激反应的因素都可能会诱生HSP，包括氧化剂(H2O2、O-2、氧自由基)、重金属(铅、砷、汞、钙等)、乙醇、氨基酸类似物、DNA损伤、缺
氧、病毒、细菌、寄生虫等感染及炎症或吞噬细胞销毁病原性异物发生呼吸爆发放出O-2及H2O2等。这些诱因会伤害细胞，致使细胞内蛋白质构型改变及功能消退，抑制蛋白质合成，
同时启动HSP基因，合成HSP。
(三) 可产生表达型与组成型【热休克蛋白60骨骼】
HSP是一个多基因家族，除热应激诱导表达型外，还有组成型，即在常温状态时就能表达。表达型与组成型在结构和功能上基本相同。
(四) 广泛参与机体的保护功能
参与有关蛋白质新生肽的折叠、亚基组装、细胞内跨膜运输、蛋白质降解及DNA和核的损伤修复等。
(五) 自我调节功能
可以调节自身转录和翻译。其转录首先需要活化热休克转录因子(HSTF)，再与热休克转录元件(HSE)相结合并磷酸化，然后开始转录。HSTF与HSE结合受到HSP的调节。例如，当细胞内HSP70升高时，HSP70即以阻遏蛋白的形式结合于HSTF，使它不能与HSE结合，而限制了HSP70的继续表达；反之，当HSP70浓度下降到一定水平以下时，不足以阻断HSTF与HSE结合，编码HSP70基因又开始转录、再合成HSP70。
四、HSP的生理功能
(一) 作为细胞内分子伴侣
HSP是祖先细胞遗留下来的、保守的、伴随细胞的一类相关蛋白，通过与具有不同功能的多种蛋白在细胞中形成复合体而参与有关蛋白质的分子折叠、转运和装配，将此种作用称为分子伴侣功能。
HSP不是直接发挥生物学作用，而是通过改变和修饰其他蛋白，影响和调节其他蛋白质的功能，发挥间接的生物学作用。具有此功能的有HSP60、HSP70和HSP90三个家族。
在生理状态下HSP70和HSP60主要参与蛋白质折叠、解折叠和组配，从而影响蛋白质的正常装配过程。HSP70和HSP60多以解折叠形式存在于细胞浆和内质网，参与蛋白质转运到内质网和线粒体的过程，影响和调节其它蛋白质的功能。HSP70可转运蛋白到线粒体膜，并参与蛋白解折叠和插入膜内，通过改变和修饰新合成的多肽，防止不正确折叠。在线粒体内HSP60结合蛋白参与蛋白的再折叠，并在以后装配成单体复合体。
属于HSP70家族的Ig重链结合蛋白(BiP)能在内质网内与Ig重链结合，结合时间是正当Ig重链与Ig轻链连接之际，这样就可防止在无Ig轻链存在情况下，重链过早地自行装配。在缺少轻链的情况下，BiP持续地与重链相结合并保留于内质网腔内，限制重链进一步装配成为完整的Ig分子。
HSP90能以ATP依赖方式抑制解折叠蛋白的聚集作用，在体外促进解折叠多肽的重新折叠。哺乳动物HSP90多以蛋白组配的形式与其它蛋白形成合成物，如钙调蛋白R、蛋白激酶、类固醇R等均系非受体酪氨酸激酶。HSP90又被称为大众伴娘，是影响基质蛋白成熟的关键因子。
(二) 细胞内家务管理功能
HSP家务管理功能(house keeping function)是指细胞(宿主细胞或病原体细胞)受到热休克(一般哺乳动物超过体温2-3℃，各种病原体由25℃转入37℃)或应激反应伤害，细胞的某些蛋白肽链伸展，失去螺旋结构和折叠状态，分子空间构型发生改变，甚至寡聚复合物解聚，诱生的HSP60或HSP70却能使蛋白肽链重新折叠，恢复螺旋构象，使之重聚，并将此蛋白分子移位至线粒体、内质网(ER)或叶绿体内，以维护细胞生存功能。
这种作用称为家务管理功能。如果不能将结构改变的肽链重新折叠，HSP就加速除去降解蛋白；如果细胞内留有降解蛋白，热休克就将导致正反馈环路作用，而诱发HSP的合成。
(三) 细胞内看守自卫功能
HSP90系类固醇(甾体激素)受体(steroid receptor)的结合蛋白，参与甾体激素与受体的相互作用，主要参与蛋白转位和受体调节。当细胞受上述伤害生成HSP90时，与类固醇受体结合。该受体在与激素结合前处于失活状态，避免受体在结合相应激素前单独与细胞核DNA相结合，防止甾体激素与DNA之间发生过早的无意义的相互作用。如果无HSP90存在，类固醇受体就比较容易与DNA结合，从而使甾体激素不能有效地与相应受体结合，发挥正常功能。HSP90家族与其结合还可激活蛋白激酶C及蛋白酶活性、ATP水解生成过氧化物岐化酶E(SOD)等，使细胞耐热，抗理化因素及反应性过氧化物伤害，以维护细胞自身的生物活性。
除HSP90外，小分子HSP家族也具有细胞看守自卫功能，HSP27主要参与微丝的稳定和细胞因子信号传导，能阻止应激状态下肌动蛋白和微丝的分裂，有利于细胞骨架的稳定；它不仅对单个细胞产生应激耐受，而且通过内皮和上皮的屏障作用，对整个有机体起到必要的保护作用。
Robaye等(1989年)发现HSP28的快速磷酸化对细胞产生立即的保护作用，并能维持很长时间。Aufricht等(1998年)证明，HSP25和HSP27在肌动蛋白动力学的调节中起主要作用，其中HSP25对缺血后肌动蛋白细胞骨架的重组具有益处。
(四) 协同淋巴细胞归巢
小分子HSP家族中的泛素和HSP90（带有两个氨基酸分枝结构也相当于泛素），组成淋巴细胞归巢受体(lymphocyte homing receptor)，附着在淋巴细胞膜，随淋巴细胞到达后高位内皮小静脉(HEV)管腔内，由该受体识别和结合血管壁高位内皮细胞(HEV)，淋巴细胞通过胞饮作用穿出血管，进入组织间隙淋巴管中，再由淋巴管返回血循环，不断循环，也可定位于周围淋巴器官的特定场所，即所谓归巢(homing)。
五、HSP在免疫应答中的作用
细胞表面的抗原受体和表面分子，如SmIg、MHC-Ⅰ类分子、MHC-Ⅱ类分子、TCR/CD3复合受体等是免疫应答的物质基础，HSP参与抗原受体肽链的折叠，促进正确装配，阻止无功能中间体聚集，促使错误折叠的抗原受体的降解，HSP通过这些方式保证免疫应答的正常进行。
(一) HSP在外源性抗原加工、递呈和Th细胞激发中的作用
HSP能辅助抗原递呈细胞(MΦ、树突状细胞、B细胞等)处理和递呈抗原至T细胞。当抗原递呈细胞摄入抗原并进入细胞质后，诱生细胞中的HSP70，并由该族HSP衍生出新的HSP
家族成员，称为肽结合蛋白72/74(PBP72/74)。这种蛋白质在抗原处理和递呈过程中起辅助作用，即由PBP72/74与抗原和ATP结合，在胞质内蛋白酶作用下，抗原裂解为肽段，再由PBP72/74将抗原肽段与细胞内的MHC-Ⅱ类分子结合成为抗原肽-MHC复合体，进而与Th细胞上的TCR-CD3复合体结合。
PBP72/74可以从抗原递呈细胞中分离出，与伴随分子/HSP70家族蛋白极为相关，它们对多肽的结合和与ATP结合的活性相同，PBPB72/74与ATP结合后能释放肽类。氨基酸的氨基末端测序研究结果表明，PBP72/74属于HSP70家族成员之一，其分子结构中含有ATP结合功能区序列GIDLG，可在所有的HSP70家族成员中发现，而GIDLG序列以外的片段序列则在HSP70家族成员中各不相同。
PBP72/74在抗原递呈细胞上表达（如MΦ和B细胞），但其表达并不依赖于MHC-Ⅱ类分子的表达。免疫电镜和流式细胞仪的研究资料表明，PBP72/74定位于细胞膜、内质网腔和内质网膜。对PBP72/74特异的抗体能抑制PBP72/74的抗原处理和递呈作用，这个发现就构成了PBP72/74与抗原处理和递呈有关的间接证据。
PBP72/74促使抗原肽和MHC-Ⅱ类分子的结合和输送已被处理的多肽至含有MHC-Ⅱ类分子的部位，在这个过程中，很有可能，MHC-Ⅱ类分子与伴随分子HSP72/74结合，促使MHC-Ⅱ类分子折叠，以能与已被处理的抗原相结合。此外，有必要将已被处理的多肽由溶酶体输送至含有MHC-Ⅱ类分子的场所，HSP在输送此种抗原至细胞膜的过程中也起到了主要作用。
(二) HSP在内源性抗原加工、递呈和CTL激发中的作用
1. HSP在内源性抗原加工递呈中的作用
HSP在内源性抗原加工中作用是在肿瘤免疫的研究中发现的。
Srivastava等对肿瘤细胞的抗原特异性进行研究，用生化方法分离肿瘤细胞的蛋白溶解物，分别研究各组小鼠抵抗活肿瘤细胞攻击的能力，结果，注射HSP提取物能使小鼠对该肿瘤细胞产生耐受，而对抗原性不同的肿瘤细胞则不产生耐受，而且来源于正常组织的HSP提取物也无保护作用，于是他们认为HSP具有免疫原性。但是，后来研究发现，从正常组织和抗原性不同的肿瘤中获得的HSP，通过cDNA序列比较，两者并无差异。野生型HSP(HSP90，gP96)和肿瘤的HSP(HSP90，gP96)序列相同，而且HSP也不表现遗传多态性，提示HSP本身并不具有免疫原性，可能是作为抗原肽的载体，真正具有免疫原性的应该是HSP所携带的抗原肽。这一现象在病毒感染中也得到证实。
目前已证实，参与诱导肿瘤和病毒特异性免疫的HSP有HSP70、HSP90和gP96。HSP70和HSP90主要存在于胞质溶胶中，而gP96主要位于内质网(ER)腔中。很多资料显示，HSP70和HSP90在胞质溶胶中结合经多种蛋白酶(如LMP)酶解后的抗原片段；gP96是ER腔中肽分子结合受体，促进MHC-Ⅰ类分子与肽分子的结合。HSP的作用不受限于肿瘤抗原和病毒抗原的差异。【热休克蛋白60骨骼】
在免疫应答的激发(致敏)期和效应期，除去CD4+或CD8+ T细胞或MΦ来研究参与以gP96-肽复合体激发对肿瘤的免疫反应的细胞类型，结果发现，gP96-肽复合体免疫的小鼠可被激发CD8T细胞反应，MΦ在此过程中是必需的，而CD4T细胞反应不是必需的。该研究也提示HSP作为抗原肽的载体参与MHC-Ⅰ类分子介导的抗原加工途径。
Srivastava等推测HSP参与MHC-Ⅰ类分子介导的内源性抗原加工过程是，内源性蛋白+ +
热休克蛋白60骨骼(二)
热休克蛋白与热休克反应
热休克蛋白与热休克反应 (一)
王晓临（综述）【热休克蛋白60骨骼】
青海大学附属医院
徐存栓（审校）
河南师范大学科技部重点实验室
张宝琛（审校）
中国科学院西北高原生物研究所 *
摘要 热休克蛋白是生物体在不良环境刺激后产生的一种特殊蛋白质，称为应激蛋白或分子伴侣，其中HSP70具有重要的细胞作用，如抗逆性，分子伴侣及抗氧化。各种应激因子引起的应激反应被称为热休克反应, 是一种以基因表达和调控变化为主的细胞应激反应。本文重点介绍HSP70的分类、结构、基因调控及功能。
关键词：热休克蛋白、热休克反应、应激、HSP70
中图分类号 R33 文献码：A
Heat shock protein and Heat shock Response (一)
Wang XiaoLin（Summarize）
: Affiliated Hospital of Medical College with QingHai University
Xu Cunshuan （Review）
National Key Laboratory of Ministry of Technological of China, Henan Normal University
ZhangBaochen（Review）
Northwest Plateau institute of Biology, the Chinese Academy of sciences
Abstract objective: The heat shock protein is a special protein that produces by organism from stimulation in hard environment. Heat shock protein70 have important function with cells, for example, hard environment resistance, chaperones. And oxidation-proof Kinds of stress factor cause stress response, Heat shock response is a stress response from gene express and regulation level.
The article introduces classification, structure, gene regulation and function with HSP70.
Key words: Heat Shock protein Heat Shock response Stress HSP70.
1.引言
1962年Ritossa等把黑腹果蝇幼虫暴露30~32C的环境中，30min后发现巨大的唾液腺染色体上出现了
新的膨突，当温度恢复到正常时，其他部位才出现类似的膨突，这些独立的膨突部位的基因具有活跃的转
录活性。1974年Tissieres和他的同事发现，经多年研究发现，生物体细胞在环境温度突然升高时，细
胞内某一蛋白质的表达迅速增加,合成了一组特殊的蛋白质, 会产生一种非常相似的反应，这一现象及期间
的产物分别被称为热休克反应（heat shock respond HSR）和热休克蛋白（heat shock proteins HSPs）
21o,
研究人员发现热休克反应除能被热损伤诱导外，还能被其他因素诱导，如氨基酸类似物、各种中金
属、代谢性毒物、缺氧、损伤等。目前将各种应激因子引起的热休克反应称为应激反应（stress response），
是以基因表达和调控方面变化为主的细胞应激反应，热休克蛋白被称为应激蛋白（stress proteins）3
热休克反应的特点是在短暂的环境温度升高（40-45C）下观察组织和细胞的变化得来的。1992年
Burel mRNA被优先翻译，发现不同分子量的热休克蛋白在细胞内的不同部位堆积。细胞对于抵抗强烈的热
损伤是必须的，但却是短暂的。
热休克反应有如下特点：①普遍性，所有的原核和真核生物都有热休克反应；②保守性，不同物种
有同源性很高的热休克蛋白；③热休克反应时热休克蛋白的合成迅速增加而原有的蛋白合成减少；④除热
损伤以外的各种刺激如缺氧，缺血，各种物理化学损伤，肿瘤等均可诱导热休克蛋白。
4o
2.热休克蛋白的分类和结构
各种生物的HSPs及其编码基因具有高度的保守性，人类与细胞的HSPs具有50%以上的同源性5。
哺乳动物中5种不同种系的细胞热休克后和HSPs的表达方式相似3。
应激蛋白的调节模式,分为两大类： HSPs和调节糖蛋白（glucose-regulated proteins，GRPs）。按分
子量大小和诱导进行分类，在哺乳动物细胞中，HSPs分为8（泛素）、10、28、32、47、60、70、90和110kPa
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